Desarrollo de metodologías más selectivas y sensibles para detección de microcistinas, basadas en reconocimiento de inmunocomplejos.

Las floraciones cianobacterianas cada vez son más frecuentes en nuestra región y dada su relevancia para la salud humana y ecosistémica, es importante aportar herramientas para mejor el conocimiento respecto a la presencia y posible impacto de sus toxinas. Las microcistinas, cianotoxinas más relevantes a nivel local y mundial, son heptapétidos cíclicos que pueden presentarse en más de 80 variantes químicas, lo que limita la capacidad de obtener datos que permitan conocer los niveles de riesgo y la toma de medidas pertinentes. El ensayo de tipo ELISA por competición, basado en un anticuerpo policlonal desarrollado en nuestro laboratorio, ha permitido monitorear microcistinas en aguas de embalses y playas mediante convenios con organismos públicos (Intendencia de Montevideo, UTE), pero el impacto en la fauna local o animales de producción es totalmente desconocido. Un problema que merece especial atención es que las cianotoxinas, especialmente las microcistinas tienen capacidad de bioacumular en diversos organismos. Su transferencia en la cadena alimentaria a especies de niveles tróficos superiores, constituye una fuente adicional de exposición para animales y seres humanos. Por tanto, se apunta a desarrollar y validar métodos de screening para la determinación de microcistinas en muestras de agua y otras matrices biológicas, que faciliten la generación de información confiable y posibiliten prevenir la exposición de personas y animales. Sin embargo, las concentraciones de toxina encontradas en tejidos de peces pueden ser muy bajas, aún el caso de que presenten severas alteraciones a nivel estructural. Esto refleja la necesidad de disponer de herramientas sencillas, selectivas y ultrasensibles, con el fin de detectar y cuantificar rápidamente la toxina en sus órganos blanco, tales como hígado e intestino y en músculo, donde las concentraciones son aún menores. Para cumplir con este objetivo, se requieren ensayos con mayor especificidad y capacidad de estandarización, por lo que este grupo de investigación ha trabajado en la generación de anticuerpos monoclonales monodominio de llama (nanobodies). Estos anticuerpos tienen numerosas ventajas frente a los policlonales: excepcional estabilidad estructural, compatibilidad con solventes usados en los extractos de tejidos y ductilidad para el desarrollo de ensayos de flujo-lateral, que permiten resultados en minutos in situ. Si bien los inmunoensayos tipo ELISA por competición, son las herramientas analíticas más usadas como screening para este tipo de moléculas pequeñas (haptenos), el uso de anticuerpos monoclonales anti-inmunocomplejo (anti-IC MAb) como anticuerpo secundario, en formatos de inmunoensayos tipo “sándwich” o de captura, posibilitan el desarrollo de herramientas más sensibles y exactas. Como alternativa a los anticuerpos anti-IC en nuestro laboratorio se ha demostrado, que se pueden utilizar péptidos pequeños aislados desde bibliotecas de fagos, como herramientas en el desarrollo de ensayos no competitivos para moléculas de bajo peso molecular. En este proyecto se propone el desarrollo y selección de péptidos y/o nanobodies anti-inmunocomplejo, utilizando como anticuerpo de captura nanobodies anti-MC seleccionados en mi trabajo posgrado. Se apunta a desarrollar inmunoensayos del tipo sándwich ultrasensibles, y explorar su uso en matrices donde se requiera alta sensibilidad tales como: aguas potables, aguas de diálisis y extractos de tejidos.